Kelas                           :          Biologi – B fakultas sains dan teknologi uin maliki malang

Tema                          :          Penggunaan biotransport dalam bidang kehidupan

    Bidang Pangan : Padi Transgenik

Judul                          :          Pengembangan Populasi Mutan Penanda

Aktivasi I: Transformasi Padi Japonic Tropis Lokal Sulawesi cv. Asemandi dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens

Padi (Oryza sativa L.) adalah salah satu tanaman budi daya penting bagi masyarakat Indonesia dan merupakan sumber nutrisi utama bagi 40% populasi dunia (Hiei dan Komari 2006). Padi juga merupakan salah satu tanaman model yang ideal untuk penelitian genomik. Hal ini disebabkan karena padi mempunyai ukuran genom yang relatif kecil dan informasi molekulernya telah dikarakterisasi dengan baik. Di samping itu, dalam penelitian rekayasa genetik, padi merupakan tanaman yang relatif efisien untuk transformasi genetik (Hirochika et al,  2004). Transformasi genetik dengan bantuan vektor  Agrobacterium secara rutin telah digunakan pada beberapa tanaman monokotil, termasuk padi. Transformasi genetik pada padi, di samping menyediakan teknologi dan metode yang efisien untuk mengintroduksikan gen-gen dengan sifat-sifat agronomi penting, tetapi juga dapat digunakan untuk mempelajari fungsi  dan regulasi gen berdasarkan informasi sekuen genom padi (Roy et al. 2000). Pendekatan knockout gen atau transposon mutagenesis (pembuatan mutan berdasarkan transposon) dapat digunakan untuk mengungkap fungsi dari gen-gen penting pada padi (Hirochika et al. 2004).

Keuntungan: Pembuatan populasi mutan dapat dilakukan dengan transformasi genetik melalui Agrobacterium tumefaciens menggunakan penanda aktivasi (activation tagging) sistem transposon Ac-Ds. Keuntungan menggunakan sistem transformasi yang dimediasi dengan Agrobacterium adalah mempunyai jumlah kopi yang relatif rendah dengan sedikit pengaturan kembali jika dibandingkan dengan metode transfer DNA secara langsung seperti penembakan partikel (Hiei dan Komari 2006). Transposisi sistem heterolog Ac-Ds ini telah menunjukkan aktivitasnya dan potensial digunakan sebagai mutagen penyisipan yang efektif (Greco et al. 2001). Dengan pendekatan ini elemen enhancerdari promoter CaMV 35S dikonstruksi dalam kendaraan elemen transposon yang bisa berpindah-pindah dalam genom padi. Elemen ini akan meningkatkan ekspresi gen-gen tetangga di dekatnya, yang mengakibatkan fenotipe gain of function (Tani et al.2004). Tanaman yang didapatkan dari teknik ini akan mengandung satu gen yang ekspresinya ditingkatkan akibat tersisipi elemen enhancer di dekat gen tersebut. Selanjutnya tanaman ini bisa diseleksi ketahanannya terhadap penyakit atau sifat lain yang diinginkan. Dari tanaman yang tahan atau dengan sifat yang diinginkan kemudian akan diisolasi gen yang bertanggung jawab terhadap perubahan tersebut dengan memanfaatkan sekuen transposon yang sudah diketahui.

Tujuan dan Manfaat: Memperoleh tanaman mutan padi transgenik dari subspesies japonica tropis lokal yang mengandung rakitan penanda aktivasi melalui trans-formasi genetik dengan A. Tumefaciens yang dapat digunakan sebagai dasar pengembangan populasi mutan penanda aktivasi untuk mendapatkan galur-galur tahan penyakit atau toleran terhadap cekaman abiotik.

Metode: Padi varietas Asemandi dan sebagai kontrol padi T309. Vektor penanda aktivasi berdasarkan transposon yang digunakan dalam penelitian ini adalah pAc-DsATag-Bar-gosGFP (Trijatmiko et al. 2005). Sedangkan metode transformasi yang digunakan berdasarkan pada metode Enckevort (2003). Vektor penanda aktivasi tersebut sudah dimasukkan ke dalam A. Tumefaciens strain Agl-1 dan siap digunakan untuk transformasi padi. Vektor penanda aktivasi ini mengandung dua elemen. Elemen pertama, yaitu elemen Ac (activator) yang mengkode enzim transposasedi bawah kontrol Ac promoter yang disambungkan dengan gen gfp (green fluorescens protein) di bawah kendali promoter Gos. Elemen kedua, yaitu elemen Ds (dissociation) berisi elemen 4x enhancer dari promoter CaMV 35S dan ketahanan terhadap basta di bawah kendali promoter Ubi. Vektor ini mengandung gen hygromycin phosphotransferase(HPT) untuk seleksi tanaman transforman.

Induksi Kalus Embriogenik . Benih padi disterilkan dengan direndam dalam alkohol 70% selama satu menit, chlorox 20% selama 30 menit dan dibilas tiga kali dengan air steril. Benih yang telah disterilkan digunakan sebagai eksplan untuk menginduksi pembentukan kalus embriogenik. Induksi kalus dilakukan dalam media yang terdiri atas media dasar NB (media yang mengandung unsur makro dari media dasar N6 (Chu et al. 1975) dan unsur mikro dan vitamin dari media dasar B5 (Gamborg dan Shyluk 1981), dengan penambahan sukrosa 30 g/l, fitagel 3 g/l, dan 2,4-D 2,5 mg/l, dengan pH 5,8. Kalus mulai terbentuk 3-4 minggu setelah penanaman eksplan dalam media. Kalus yang dihasilkan dipindahkan pada media induksi kalus yang sama. Kalus hasil subkultur pertama yang berumur tidak lebih dari 2 minggu dan yang bersifat embriogenik digunakan sebagai eksplan untuk transformasi.

Persiapan Bakteri A. Tumefaciens dan Ko-kultivasi . Koloni Agrobacterium yang mengandung vektor penanda aktivasi ditumbuhkan pada media YEP cair yang mengandung antibiotik karbenisilin 75 mg/l dan kanamisin 100 mg/l selama semalam pada inkubator yang bergoyang dengan suhu 28°C. Selanjutnya 500 ul kultur tersebut ditumbuhkan pada media AB padat yang mengandung antibiotik karbenisilin 75 mg/l dan kanamisin 100 mg/l, selama 3 hari pada suhu 28°C. Kultur Agrobacterium kemudian dilarutkan pada media ko-kultivasi cair, yaitu media dasar R2 (Ohira et al.1973) dengan penambahan 2,4-D 2,5 mg/l, glukosa 10 g/l, dan asetosiringon 100 uM, dengan pH 5,2. Kalus - kalus padi embriogenik direndam dalam suspensi Agrobacterium selama 15 menit. Selanjutnya kalus dipanen dan dikeringkan pada kertas saring steril. Kalus ditransfer ke media ko-kultivasi padat, yang terdiri dari media dasar R2 dengan penambahan 2,4-D 2,5 mg/l, glukosa 10 g/l, asetosiringon 100 uM, dan fitagel 3 g/l, dengan pH 5,2, selama 4 hari pada suhu 25°C dalam kondisi gelap.

Seleksi Kalus pada Media Seleksi. Kalus-kalus hasil transformasi diseleksi pada me-

dia seleksi yang terdiri dari media dasar R2 dengan penambahan 2,4-D 2,5 mg/l, sukrosa 30 g/l, dan fitagel 3 g/l, higromisin 50 mg/l, sefotaksim 400 mg/l, vankomisin 100 mg/l, dengan pH 6. Kalus disubkultur pada media yang sama selama 2 x 2 minggu. Kalus-kalus yang tahan dan menunjukkan tanda-tanda embriogenik dipindahkan ke media induksi embrio yang terdiri

dari media dasar LS (Linsmaier dan Skoog 1965) dengan penambahan 2,4-D 2,5 mg/l, sukrosa 30 g/l, air kelapa 100 ml/l dan fitagel 3 g/l, higromisin 50 mg/l, sefotaksim 100 mg/l, dan vankomisin 100 mg/l, dengan pH 5,8, selama kurang lebih satu minggu.

Regenerasi Kalus dan Induksi Perakaran. Setelah didapatkan kalus yang embriogenik (diseleksi dengan mikroskop binokuler), kalus kemudian dipindahkan ke media regenerasi. Media regenerasi yang digunakan adalah media dasar LS dengan penambahan IAA 0,5 mg/l, BAP 0,3 mg/l, sefotaksim100 mg/l, vankomisin 100 mg/l, higromisin 30 mg/l, sukrosa 40 g/l, dan fitagel 7 g/l, dengan pH 5,8. Selanjutnya, kultur diinkubasikan dengan penyinaran 1.000 lux selama 16 jam sehari dalam ruang kultur bersuhu 28°C. Kalus secara kontinyu dipindahkan ke media regenerasi yang masih segar setiap 2 minggu hingga terbentuk tunas. Untuk menginduksi pembentukan planlet, tunas diakarkan dalam media perakaran, yaitumedia dasar LS, dengan penambahan higromisin 40 mg/l, sukrosa 30 g/l, dan fitagel 3g/l, dengan pH 5,8 selama dua minggu atau sampai dengan terbentuk akar.

Aklimatisasi. Aklimatisasi dilakukan secara bertahap dengan menanam planlet selama satu minggu dalam tabung reaksi berdiameter 1,5 cm dan tinggi 15 cm yang berisi 5 ml air dan selama dua minggu dalam bak plastik ukuran 44 cm x 34 cm x 15 cm yang berisi tanah sawah. Planlet yang bertahan hidup dalam periode aklimatisasi selanjutnya dipindahkan ke dalam pot plastik dengan volume 10 l yang berisi tanah sawah.

Analisis Molekuler Gen dengan Teknik PCR.

1.      Isolasi DNA Total dari Tanaman. dilakukan menggunakan metode Shure et al (1983). DNA yang didapatkan kemudian diukur konsentrasinya menggunakan spektrofotometer. Selanjutnya DNA diencerkan dengan ddH 20 untuk mencapai konsentrasi 10 ng/ul. DNA ini siap digunakan untuk analisis PCR.

2.      Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR. dilakukan menggunakan sepasang primer untuk gen ketahanan basta (bar). Sekuen primer yang digunakan adalah Bar-Forward 5’ACC ATG AGC CCA GAA CGA CGC 3’,sedangkan Bar-Reverse5’ CAG GCT GAA GTC CAG CTG CCA G 3’. Total volume reaksi PCR adalah 20 μl yang mengandung DNA genomik cetakan 100 ng, 0,2 uM untuk masing-masing dNTP, primer Forward dan Reversemasing-masing dengan konsentrasi 100 ng/ul, MgCl2 dengan konsentrasi 1,5 mM, enzim Taq DNA polymerase 0,16 unit dalam larutan bufer 1x. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR (PCT-100, MJ Research Inc. USA) dengan program sebagai berikut: tahap denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 60°C selama 30 detik, dan pemanjangan/sintesis DNA pada suhu 72°C selama 45detik. Tahapan program PCR tersebut diulang sebanyak 35 siklus. Pada tahap terakhir proses PCR dilakukan pemanjangan akhir pada suhu 72°C selama 5 menit. Setelah proses PCR selesai, sampel disimpan pada suhu 15°C atau bisa langsung divisualisasi dengan elektroforesis gel agarosa.

3.      Elektroforesis Produk PCR pada Gel Agarosa. Sebanyak 10 μl produk PCR dari masing-masing sampel ditambahkan dengan 2 μl loading dye dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam sumur pada agarosa gel 1% dengan bufer TAE 1x. Untuk menentukan ukuran dari produk PCR disertakan juga DNA standar (1 kb plus ladder) sebagai pembanding.   Sampel DNA tersebut dielektroforesis dengan tegangan 90 volt selama kuranglebih 1,5 jam. Setelah itu, agarosa gel diwarnai dengan larutan etidium bromida 10 mg/l selama 10 menit dan dicuci dengan air selama 20-30 menit. Fragmen-fragmen DNA pada agarosa gel kemudian divisualisasi dengan Chemidoc sel system (Biorad).

Hasil: Telah diperoleh 17 lini independen (304 tanaman) padi transgenik japonica tropis lokal Sulawesi cv. Asemandi yang positif mengandung rakitan penanda aktivasi.Transformasi genetik padi dengan vektor A. Tumefaciens yang mengandung rakitan penanda aktivasi telah dilakukan pada tanaman padi Asemandi, sedangkan T309 digunakan sebagai kontrol transformasi. Dari dua kultivar padi yang ditransformasi, semuanya dapat menghasilkan lini-lini yang tahan pada media seleksi antibiotik higromisin dan menghasilkan jumlah lini independen yang berbeda. Lini-lini starter tersebut akan dikembangkan lebih lanjut dengan selfing beberapa generasi untuk mendapatkan lini-lini mutan penanda aktivasi yang stabil.