Nama   : Ilham Siti Rukhana

Nim     :13620060

Kelas   :Biologi B

dewasa ini bakteri tidak hanya menjadi hal yang berbahay bagi manusia namun bakteri kini telah banyak dimanfaatkan untuk berbagai kepentingan baik pada bidang industri, pertanian, pertambangan bahkan dalam bidang kesehatan. Agar bakteri yang dimanfaatkn sesuai dengan kebutuhan maka harus dilakukan identifikasi bakteri terlebih dahulu. berikut adalah cara yang digunakan dalam identifikasi bakteri: 

IDENTIFIKASI BAKTERI

1. Pemeriksaan Mikroskopis

a. Pemeriksaan Langsung

Pemeriksaan langsung digunakan untuk mengamati pergerakan, dan pembelahan secara biner, mengamati bentuk dan ukuran sel yang alami, yang pada saat mengalami fixasi panas serta selama proses pewarnaan mengakibatkan beberapa perubahan. Cara yang paling baik adalah dengan membuat sediaan tetesan gantung.

b. Pewarnaan

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan.

a). Untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan acidfast /tahan asam untuk Mycobacterium.

b). Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagel, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologis dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik. Caranya tidak sulit tetapi membutuhkan kehati-hatian dalam pembuatannya.

Teknik dasar pewarnaan sel bakteri untuk pengamatan mikroskopik ensial diantaranya:

1). Agar Garam Mannitol

Mengandung konsentrasi garam tinggi (7,5% NaCl), yang dapat menghambat pertumbuhan kebanyakan bakteri, kecuali staphylococcus. Media ini juga mengadakan fungsi differensial karena mengandung karbohidrat mannnitol, dimana beberapa staphylococcus dapat melakukan fermentasi , phenol red (pH indikator) digunakan untuk mendeteksi adanya asam hasil fermentasi manitol. staphylococcusi ini memperlihatkan suatu zona berwarna kuning di

sekeliling pertumbuhannya, staphylococcus yang tidak melakukan fermentasi tidak akan menghasilkn perubahan warna.

2). Agar Darah

Darah dimasukkan ke dalam medium untuk memperkaya unsur dalam penanaman mikroorganisme pilihan seperti Streptococcus sp. Darah juga akan memperlihatkan sifat hemolysis yang dimiliki streptococcusi.

3). Agar McConkey

Menghambat pengaruh kristal violet terhadap pertumbuhan bakteri gram-positif, selanjutnya bakteri gram-negatif dapat diisolasi. Media dilengkapi dengan karbohidrat (laktosa), garam empedu, dan neutral red sebagai pH indikator yang mampu membedakan bakteri enterik sebagai dasar kemampuannya untuk memfermentasi laktosa. Pada dasarnya bakteri enterik dipisahkan ke dalam dua kelompok:

4). Agar Eosin-Methylene Blue (EMB agar)

Laktosa dan zat pewarna eosin serta metilen biru mampu membedakan antara enterik fermenter laktosa dengan nonfermenter sebaik identifikasi terhadap basilus colon Escherichia coli. Koloni E. coli tersebut kelihatan biru kehitaman dengan kilat hijau logam/metalik yang disebabkan besarnya kuantitas asam yang dihasilkan dan pengendapan zat pewarna di atas permukaan pertumbuhan. Bakteri coliform lain seperti Enterobacter aerogenes terbentuk tebal, mukoid, koloni berwarna pink diatas medium ini. Bakteri enterik nonfermenter laktosa membentuk koloni tidak berwarna maka kelihatan transparan, kelihatan di atas medium yang berwarna ungu (merah lembayung). Medium ini juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri gram-positif, sedangkan bakteri gram-negatif tumbuh lebih baik.

5). Agar DarahTelurit

Untuk megisolasi Corynebacterium digunakan agar darah telurit (Mc Leod), sebagai media selektif, setelah inkubasi selama 24 jam koloni bakteri terlihat berwarna abu-abu tua-hitam. Selanjutnya untuk biakan murni Corynebacterium digunakan media perbenihan Loeffler dalam tabung.

6). Agar Tioglikolat/Tarrozi (Perbenihan Anaerob)

Perbenihan tioglikolat, mengandung asam tioglikolat yang dapat mengikat oksigen sehingga tercapai suasana anaerob dalam perbenihan. Perbenihan Tarrozi, kaya akan enzim peroksidase sehingga zat toksik (H2O2) yang dihasilkan Clostridium tetani berubah menjadi tidak toksik (H2O dan O2) dan kuman dapat tumbuh terus dalam perbenihan.

7). Agar TCBS dan Agar Monsur

Agar TCBS (thiosulfat citrat bile sucrose), Agar Monsur (mengandung telurit gelatin agar  atau agar bulyon alkalis yang mengandung Na-tourokholat), digunakan untuk mengisolasi genus Vibrio. Setelah diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C di atas media berwarna hijau kehitaman koloni akan terlihat bundar berwarna kuning muda, transculent dan permukaannya rata.

8). Agar Coklat atau Thayer-Martin

Media agar coklat (Thayer-Martin) merupakan media terpilih untuk genus Neisseria. Untuk pertumbuhannya diperlukan suasana anaerob(fakultatif) dengan sedikit gas CO2 dan tidak boleh kekeringan, sehingga pembiakan yang cocok digunakan dalam eksikator yang diberi kapas basah pada bagian bawah petri yang berisi biakan.

9). Media Agar Lowenstein-Jensen

Media padat tersebut banyak digunakan untuk perbenihan genus Mycobacterium, bakteri ini dapat tumbuh walaupun dalam waktu relatif lama, kecuali jenis atipik golongan “rapid growers” dapat tumbuh dalam 3-7 hari.

Aktivitas Biokimia Mikroorganisme

Mikroorganisme dapat dipisahkan dan diidentifikasi karena berbagai alasan yaitu: Determinasi patogen yang bertanggung jawab terhadap penyakit menular. Seleksi dan isolasi strain mikroorganisme fermetatif penting untuk industri penghasil alkohol, pelarut, vitamin, asam organik, antibiotik, dan industri enzim. Isolasi dan perkembangan strain mikrobia yang cocok untuk pabrik dan peningkatan kualitas dan rasa dalam bahan-bahan makanan tertentu seperti yogurt, keju, produk susu.

Uji Aktivitas Biokimia Mikroorganisme

Pengubahan biokimia tersebut penting untuk fungsi dan pertahanan sel, dan sebagai dasar metabolisme seluler. Akibat proses-proses metabolime tersebut produk metabolik dibentuk dan diekskresikan oleh sel ke lingkungan. Pengujian produk akhir tersebut tidak hanya membantu dalam identifikasi sistem enzim spesifik, tetapi juga untuk mengidentifikasi, memisahkan, dan mengklasifikasi mikroorganisme. Berikut ini sebuah skema sederhana tentang prosedur percobaan untuk mempelajari aktivitas eksoenzim dan endoenzim pada mikroorganisme.

1.      Fermentasi Karbohidrat

Kemampuan memfermentasikan berbagai karbohidrat dan produk fermentasi yang dihasilkan merupakan ciri yang dapat diidentifikasi pada mikroorganisme. Hasil akhir dari fermentasi karbohidrat ini ditentukan oleh sifat mikroba, media biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan antara lain pH dan suhu. Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasi dan difermentasikan oleh mikroorganisme. Glukosa merupakan senyawa yang paling sering digunakan oleh mikroorganisme dalam proses fermentasi itu. Selain itu terdapat pula media sukrosa dan laktosa.

Beberapa mikroorganisme seperti E. coli, dapat menggunakan laktosa sebagai sumber karbon. Selain laktosa, substrat alamiah dari enzim, adalah bahan yang sangat penting, ONPG (o-nitro-phenyl-β-Dgalactopyranoside), dapat digunakan pula. Β-galaktosidase dapat mengkatalisis ONPG dengan reaksi sebagai berikut :

β-galaktosidase
ONPG + H20galaktosa + o-nitrofenol

ONPG tidak berwarna tetapi setelah hidrolisis menjadi o-nitrofenol, akan timbul warna kuning pada larutan yang alkali. Tes ini dapat digunakan utuk identifikasi beberapa jenis bakteri.Berikut ini beberapa jenis bakteri yang mampu melakukan fermentasi terhadap karbohidrat serta hasil fermentasinya, adalah :

a) Fermentasi asam laktat : bakteri asam laktat (Streptococcus, Lactobacillus)

b) Fermentasi alkohol : Zygomonas, Saccharomycetes

c) Fermentasi asam propionate : bakteri asam propionate (Propionibacterium)

d) Fermentasi 2,3-butanadiol : Enterobacter, Serralia, Bacillus.

e) Fermentasi asam campuran : bakteri enterik (Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus)

f) Fermentasi asam butirat : Clostridium

2.      Uji MRVP

Uji metil red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Dimana beberapa bakteri dapat memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih rendah. Uji ini dilakukan untuk menghasilkan asam melalu proses hidrolisis yang menghasilkan asam organik sederhana.

Pengujian dengan menggunakan metil merah, Voges-Proskeuer, Uji Indole serta uji penggunaan sitrat sering dikenal sebagai tes IMViC (indole, methyl red, Voges-Proskueur, dan citrate, serta “i” adalah merupakan huruf penghubung). Tes IMViC ini digunakan untuk membedakan beberapa bakteri golongan Enterobacteriaceae, berdasarkan kemampuannya dalam memfermentasi glukosa dan laktosa, penguraian triptosan yang menghasilkan indole serta adanya enzim sitrat permease yang mampu menguraikan natrium sitrat dari medium khusus yang digunakan.

3.      Uji katalase

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguarikan zat toksik tersebut.Uji katalase ini dilakukan untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk kokkus, dalam membedakan Staphylococcus dan Streptococcus. Dimana kelompok streptococcus bersifat katalase negative dan Staphylococcus bersifat katalase positif.

Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2 dengan menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan kompenen sel dengan sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan diri seperti dengan produksi O2 atau akan terbunuh.Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis superoksids yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang dapat mendekstruksi hidrogen peroksida.

4.      Uji Produksi Indol

Mikroorganisme menggunakan asam amino sebagai pemuka protein, komponen sel dan kadang kala sebagai sumber energi. Asam amino ini dimodifikasikan dengan berbagai cara sewaktu metabolisme.. Dimana modifikasi asam amino dapat digunakan untuk pengidentifikasian untuk suatu jenis bakteri. Untuk uji ini, digunakan medium cair yang kaya akan triptofan yaitu dalam bentuk tripton 1% sebagai sumber karbon. Indol yang terbentuk akan berwarna merah dengan penambahan reagen Kovach atau Erlich yang mengandung p-dimetilbenzaldehid. Dikatakan positif apabila senyawa ini menghasilkan senyawa para amino benzaldehid yang tidak larut dalam air dan membentuk warna merah pada permukaan medium.

5.      Uji deaminase asam amino

Deaminasi adalah proses mengkatalisasi pemindahan gugus amino (NH2) dari asam amino dan molekul lainnya yang mengandung –NH. Asam organik yang dihasilkan dapat digunakan mikrooganisme untuk biosintesis. Selain itu, proses deaminasi menetralisasikan amin yang menghambat pertumbuhan. Uji deaminasi asam amino dapat digunakan untuk identifikasi mikroorganisme aluran pencernaan. Untuk melakukan uji ini, mikroorganisme ditumbuhkan dalam medium biakan yang mengandung asam amino yaitu peptone cair. Dan pada pengamatan ditambahkan reagen Nessler sebanyak 1 tetes. Reagen Nessler ini merupakan pereaksi spesifik untuk identifikasi adanya ammonia (NH3).Hasil uji positif jika pada akhir pengamatan menunjukkan perubahan warna kuning, karena warna kuning menunjukkan bahwa asam amino telah dideaminasi.

6.      Penggunaan sitrat

Uji sitrat merupakan salah satu pengujian dari kelompok tes IMViC. Pengujian ini digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini digunakan medium sitrat koser (SCA) yang merupakan medium sintetik dengan Na sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon,
NH4+ sebagai sumber N dan indikator BTB (Brom Timol Blue) yang merupakan indikator pH.  Bila mikroba mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru.

Citrat permease

Natrium sitrat Asam piruvat + Asam oksaloasetat + CO2

Citratase

Kelebihan natrium dari Na.sitrat + CO2 + H2ONa2CO3

(alkali), pH meningkat (indicator BTB menunjukkan warna biru).

7.      Uji motility

Motilitas adalah salah satu dari ciri mahluk hidup, begitu pula dengan mikroorganisme, namun alat geraknya masih sederhana berupa flagella atau cilia. Bakteri melakukan motilitas dengan menggunakan energi yang diperoleh dari ATP yang diuraikan oleh koenzim ATP-ase membentuk fosfo a